Доклинические исследования нового заменителя стекловидного тела "Витреолон"

Источник: https://eyepress.ru/article.aspx?28080

Алексеев И.Б., Коригодский А.Р., Иомдина Е.Н., Федоров А.А., Белкин В.Е., Самойленко А.И., Барышева Ю.К.

В настоящее время для проведения оперативных вмешательств в витреальной полости остро стоит вопрос о применении искусственных заменителей стекловидного тела по своим основным характеристикам, идентичным нативному стекловидному телу. Многолетний опыт отечественных и зарубежных исследователей и собственная хирургическая практика показывают, что от состояния нативного стекловидного тела или его искусственного заменителя во многом зависят положительный исход большинства оперативных вмешательств и предотвращение основных проблем витреоретинопатии, таких как рецидивы отслойки сетчатки в послеоперационном периоде, которые развиваются вследствие недостаточной адаптации и фиксации сетчатки в зоне разрыва, и прогрессирование ПВР.

    Именно поэтому разработка и апробация новых видов заменителей стекловидного тела остается сегодня актуальной проблемой в офтальмологии.

    Понимая важность характеристик искусственного стекловидного тела (ИСТ) при оперативном вмешательстве и в период реабилитации, а также необходимость в его максимальной биосовместимости, сегодня усилия многих исследователей направлены на поиск новых искусственных заменителей, наиболее приближенных к нативному стекловидному телу.

    За последнее время был достигнут значительный прогресс в этой области, была усовершенствована техника проведения витреальных операций и предложены новые оптические системы, различные заместители стекловидного тела, в том числе жидкие перфторорганические соединения (ПФОС) и силиконовое масло. Однако все используемые заменители стекловидного тела имели те или иные недостатки.

    Так, например, с разной степенью успешности, апробацию прошли различные типы гидрогелей: натуральные (гиалуроновая кислота, альгинаты, хондроитин сульфат, декстраны, желатин), полусинтетические (производные целлюлозы) и синтетические – на основе полиэтиленоксида, полиакриламида, полиакриламида гликолата (метиловый эфир), поливинилового спирта, полигидроксиэтилакрилата, полиглицерилметакрилата, поли-N-винилпирролидона и некоторых других компонентов.

    Исследования показали, что ни один из них не отвечает в полной мере требованиям, предъявляемым к ИСТ. Основная проблема состоит в том, что через некоторое время после введения (обычно через 2-4 недели) гидрогели были подвержены деградации и вакуолизации из-за фагоцитоза и послеоперационных воспалительных процессов. Также при инъекции гелей из-за возникающих больших сдвиговых усилий при прохождении через иглы малого диаметра, в большинстве случаев наблюдалась их фрагментация, приводящая к необратимой деструкции (деградации), изменению структуры и потере начальных физико-химических и физико-механических свойств.

    В настоящее время для создания искусственного стекловидного тела наиболее перспективными являются гидрогели-полимеры (обычно сшитые), содержащие в своей структуре значительное количество сорбированной воды. По своим свойствам гидрогели в наибольшей степени схожи с нативным стекловидным телом: имеют высокое влагосодержание, прозрачность, необходимые вискоэластические свойства, нетоксичность, способны инжектироваться через канюли.

    В течение последних лет в ООО «ХайБиТек» проводились целенаправленные работы по созданию гидрогелевого ИСТ, лишенного указанных выше недостатков. В результате был разработан гидрогелевый протез стекловидного тела «Витреолон», не имеющий отечественных и зарубежных аналогов.

    «Витреолон» представляет собой слабосшитый гидрогель на основе сополимера N-винил-пирролидона и акриловых сомономеров, полученный из мономеров в процессе радикальной полимеризации. Это прозрачный бесцветный или слегка желтоватый гель, имеющий равновесное влагосодержание 93,5-94,2 мас. %, коэффициент преломления 1,345-1,350 и пропускание света 93-95%.

    По основным характеристикам и консистенции «Витреолон» близок к нативному стекловидному телу.

    Он биологически инертен, стабилен в водных биологических средах, не вызывает и не поддерживает воспалительные процессы, не проникает под сетчатку, не вызывает изменения в тканях, непосредственно контактирующих с материалом, включая сетчатку глаза и цилиарное тело. Кроме того, в отличие от силиконов, это гидрогелевое ИСТ проницаемо для внутриглазной жидкости, вследствие чего не нарушает ее обмен в полости глазного яблока.

    Цель

    Провести экспериментальное исследование нового заменителя стекловидного тела и изучить его возможности, эффективность применения в качестве постоянного тампонирующего вещества.

    Материал и методы.

    Экспериментальная стадия изучения ИСТ «Витреолон» проводилась на на глазах 31 половозрелого кролика (62 глаза) весом от 2,5 до 3 кг.

    В связи с тем, что для опытов не всегда удается подобрать кроликов одного веса, было принято решение воспользоваться методом определения объема стекловидного тела, основанном на зависимости объема стекловидного тела от диаметра роговицы кролика, предложенного Лебеховым П.И., который производил измерения вертикального диаметра роговицы на глазах живых кроликов. Согласно авторской методике, после энуклеации глаза разрезали по экватору, передний их отрезок удаляли, а стекловидное тело целиком выдавливали в мерный стаканчик.

    Лебехов П.И. выявил четыре размера вертикального диаметра роговицы – 15,0; 15,5; 16,0 и 16,5 мм. Каждому из них соответствовал определенный объем стекловидного тела, причем прослеживалась строгая зависимость объема стекловидного тела от вертикального диаметра роговицы: чем больше диаметр роговицы, тем больше объем стекловидного тела.

    В нашем исследовании измерение вертикального диаметра роговицы кроликов проводилось с помощью шаймпфлюг-камеры Galilei G2 (Ziemer Ophthalmic Systems AG 6.0.2), которая является высокоточным неинвазивным анализатором переднего сегмента глаза. Этот прибор сочетает в себе две технологии: кольца Пласидо и две шаймпфлюг-камеры, что позволяет делать трехмерный анализ структур переднего отдела глаза и получать различные биометрические параметры, в том числе проводить пахиметрию роговицы, кератометрию передней и задней поверхностей роговицы с созданием топографических карт, определять глубину передней камеры, плотность роговицы, диаметр роговицы по вертикали и горизонтали от лимба до лимба.

    Для исследования возможного токсикологического действия «Витреолона» на ткани глаза было отобрано 25 кроликов, которым после удаления нативного стекловидного тела в витреальную полость глаза вводился «Витреолон». В ходе эксперимента оценивалось взаимодействие ИСТ с тканями глаза кролика (50 глаз). Сроки наблюдения составили от одной недели до 9 мес.

    Перед началом опыта кролику внутримышечно проводилась премедикация препаратом Димедрол 0,2 мл и препаратом Преднизолон 0,3 мл. Через 15 минут внутримышечно вводился Золетил 0,5 мл. Кролика помещали в стерильную хирургическую пеленку и фиксировали веревкой. Этот способ позволяет фиксировать быстро, надежно и безопасно для исследователя, а также не доставляет физического и психического дискомфорта животному, которое к моменту

    Экспериментально-лабораторные исследования фиксации уже находилось в состоянии медикаментозного сна.

    В конъюнктивальную полость проводилась инстилляция препаратом Тобрекс (Alcon). После трехкратной инстилляции препарата Алкаин (Alcon) в конъюнктивальный мешок вводился обратной стороной общехирургический пинцет для выведения глазного яблока из-под век. Стоит отметить, что это процедура безопасна для животного и абсолютно безболезненна, так как кролики даже без наркоза на процедуру не реагируют.

    Затем в верхне-наружном отделе в 2 мм от лимба через конъюнктиву прошивалась склера и накладывался предварительный узловой шов 8-0, концы которого не завязывались. С помощью шприца и надетой на него иглы 21G косо входили в полость глаза по направлению к зрительному нерву на глубину 2 мм.

    Через рану осторожно отсасывали примерно 3/4 объема стекловидного тела в соответствии с расчетами, приведенными в табл.

    Через неизвлеченную иглу, после отсасывания стекловидного тела, другим шприцом с набранным заменителем в стекловидное тело медленно вводили имплантат до получения легкой гипертензии глазного яблока. Одновременно с извлечением иглы из полости глаза ассистент затягивал склеральный шов.

    В глаз инстиллировали препарат Тобрекс. Все манипуляции в опытах проводили с соблюдением стерильности. Первая послеоперационная проверка проводилась через сутки. В ходе осмотра отмечалось, что после введения «Витреолона» глаза спокойны, без признаков инфекции, рефлекс глазного дна розовый.

    Как показывает клиническая практика, одна неделя – оптимальный срок для контрольной проверки после операции. Это позволяет увидеть воспалительные явления, если они были, и сделать прогноз о ходе дальнейшего течения послеоперационного периода. Через неделю эксперимента на разрезе энуклеированного глазного яблока, проведенном в непосредственной близости от места введения препарата, через прозрачное стекловидное тело можно было различить небольшую округлую зону гиперпигментации. У подавляющего большинства прооперированных кроликов подлежащая склера была локально истончена, собственно сосудистая оболочка наоборот утолщена. По периферии пигментированного участка можно было наблюдать под сетчаткой образование циркулярного полупрозрачного валика с отдельными вкраплениями темно-бурого пигмента. Остальная сетчатка прилежала к увеальной оболочке, сохраняя свою прозрачность. Все внутренние структуры глаза были сохранены, в стекловидной, задней и передней камерах отсутствовали какие-либо преципитаты, геморрагии, шварты, синехии. Признаков воспаления не наблюдалось.

  Для изучения тампонирующих свойств «Витреолона» и проведения сравнения с силиконовым маслом у подопытных кроликов была смоделирована отслойка сетчатки глаза. Животные были разделены на 2 группы. В первой группе тампонирующим веществом являлось силиконовое масло 1000 sSt (6 глаз), во второй – «Витреолон» (6 глаз). В ходе эксперимента оценивались и сравнивались их тампонирующие свойства.

    Условия подготовки кроликов ко второму этапу эксперимента, анестезия, стерильность и условия проведения оперативного вмешательства, были точно такие же, как и во время проведения первого этапа.

    Моделирование отслойки сетчатки было проведено следующим образом: по меридиану 6 часов в 5 мм от лимба отсепаровывалась конъюнктива и формировался склеральный лоскут треугольной формы. С помощью иглы 27G в субретинальное пространство вводился физиологический раствор (0,9% NaCl) под визуальным контролем. Склеральный лоскут ушивался. Лишняя внутриглазная жидкость выводилась через заранее сформированный парацентез роговицы.

    Далее под контролем микроскопа и контактной линзы с помощью иглы 21G был сформирован разрыв уже отслоенной сетчатки.

    Дальнейшее введение тампонирующих веществ осуществлялось по принципу, описанному выше, с той разницей, что силиконовое масло вводилось с помощью специальной короткой канюли, что значительно облегчало его имплантацию.

    Послеоперационный контроль внутриглазного давления осуществлялся с помощью тонометра Tonovet, компании Icare (Финляндия).

    Дополнительно нами проведено гистологическое исследование удаленных в ходе хирургическо-го вмешательства биоптатов. Для этого использовали метод полутонких срезов. Образцы ткани размерами фиксировали в холодном 2,5% растворе глютаральдегида в течение 2-8 часов. После промывания в фосфатном буфере образцы фиксировали в 1% растворе осмиевой кислоты в течение одного часа, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, ацетоне и заливали в смесь эпоксидных смол эпонаралдит. Поперечные полутонкие срезы толщиной 0,5-1,5 мкм готовили на «Ультратоме-IV» (LKB, Швеция), которые окрашивали метиленовым синим и фуксином (полихромное окрашивание).

    Полученные гистологические препараты исследовали на световом микроскопе Leica DM-2500.

    Фоторегистрацию осуществляли на цифровую фотокамеру Leica DFC320 при разных увеличениях с последующим морфометрическим анализом изображений с помощью программного обеспечения ImageScope Color. Гистологическое исследование выполнено в лаборатории фундаментальных исследовании в офтальмологии (руководитель – к.м.н. А.А. Федоров) ФГБНУ «НИИ глазных болезней».

    Результаты и обсуждение

    В ходе проведенных экспериментов подтвердилось, что «Витреолон» обладает тиксотропными свойствами: при введении препарата (под нагрузкой) его вязкость значительно уменьшается, а затем после имплантации восстанавливается в витреальной полости вследствие процессов самоструктурирования.

    Проведенные испытания показали, что для его введения может быть использована канюля 21G. Кроме того, в случае необходимости «Витреолон» может легко извлекаться из полости глаза и заменяться с помощью такой же канюли 21G.

    В результате второго этапа эксперимента было выявлено, что препарат «Витреолон» ничем не уступает тампонирующим свойствам силиконового масла: держит объем, не расширяется, сохраняет поверхностное натяжение и удерживает сетчатку на месте. Однако по сравнению с силиконовым маслом ИСТ «Витреолон» более стабилен и сохраняет все свои основные характеристики на протяжении длительного времени. Через год наблюдения после опе-рации у половины кроликов с веденным силиконовым маслом наблюдалась вторичная гипертензия, увеит и эмульгирование силиконового масла.

    Впервые в условиях эксперимента была подтверждена безопасность использования нового отечественного заменителя стекловидного тела «Витреолон», в том числе и при его применении как постоянного тампонирующего вещества при отслойке сетчатки.

    Доказано, что ИСТ «Витреолон» может быть использовано для длительной тампонады витреальной полости глазного яблока после проведенной витрэктомии.

    Гистологическое исследование показало, что интравитреальное введение препарата «Витреолон» не обладает токсическим действием на внутренние структуры глаза. Цилиарный эпителий, волокна цинновой связки, радужка, задний эпителий роговицы во всех исследованных препаратах (62 образца) сохраняли свою обычную структуру. Результатом проникающего механического травмирования инъекционной иглой было локальное повреждение сетчатки, небольшое кровоизлияние в стекловидном теле. На гистологических препаратах переднего отрезка глаза после введения препарата в передней, задней и стекловидной камерах глаза отсутствовали признаки экссудации, преципитации, а также воспалительной инфильтрации. Внутренние среды глаза оставались прозрачными без кровоизлияний и разрастаний фиброзной ткани, задний эпителий роговицы прослеживался на всем протяжении. Эпителий цилиарных отростков просматривается без признаков десквамации. Область основания стекловидного тела не контурировала.

    Обнаружено, что после проведенных экспериментов ретинальные сосуды, слой нервных волокон, нейроны сетчатки остались без изменений. Слой миелинизированных нервных волокон сетчатки с ретинальными сосудами и разделяющая их внутренняя пограничная мембрана оставались полностью сохранными и практически не отличались от контралатерального (контрольного) глаза.

    В ходе эксперимента было выявлено, что наложение швов на склеру несколько ускоряло процессы заживления и герметизации раны.

    Заключение

    Доклинические исследования показали прекрасные результаты по биосовместимости нового заменителя стекловидного тела «Витреолон» и его устойчивости к сдвиговым напряжениям (нагрузкам), возникающим в процессе инъекции. Была доказана его безопасность и выявлено, что препарат не оказывает никакого системного или местного токсического действия, не вызывает повышение внутриглазного давления (ВГД) на всех сроках наблюдения, и в течение длительного времени сохраняет свою прозрачность.

    При применении нового заменителя стекловидного тела осложнения в послеоперационном периоде возможны, но не выходят за рамки существующих осложнений при тампонаде силиконовым маслом. Важен контроль ВГД после вмешательства и, при необходимости, его стабилизация. Однако эксперимент показал, что в отличие от силиконов, ИСТ «Витреолон» проницаемо для внутриглазной жидкости, вследствие чего опосредованно не подавляет деятельность цилиарного тела.

    Так же при длительном использовании «Витреолон» не эмульгирует и не мигрирует в переднюю камеру глаза.

    Еще одним важным выводом проведенного доклинического исследования стало удобство применения нового заменителя стекловидного тела «Витреолон» в хирургической практике. Использование этого препарата позволяет минимизировать операционную травму глаза, сокращая количество хирургических этапов до одного, и дает возможность проводить лечение отслойки сетчатки с любой локализацией разрывов.

    Результаты проведенной работы открывают перспективы применения нового заменителя стекловидного тела в клинической практике. На наш взгляд, ИСТ «Витреолон» позволит полностью уйти от тех проблем, которые присущи существующим заменителям стекловидного тела, и способен стать единственным постоянным тампонирующим веществом на сегодняшний день. Полученные данные могут быть использованы как базисные для построения дизайна и алгоритма предстоящего клинического исследования, которое поможет повысить эффективность витреоретинальных операций и внедрить новый заменитель стекловидного тела «Витреолон» в хирургическую практику.

   

    Сведения об авторах

    Алексеев Игорь Борисович – докт. мед. наук, профессор кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ

    Иомдина Елена Наумовна – докт. биол. наук, профессор, гл. науч. сотрудник отдела патологии рефракции, бинокулярного зрения и офтальмоэргономики ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России

    Коригодский Александр Робертович – канд. хим. наук, зам. ген. директора ООО «ХайБиТек»

    Федоров Анатолий Александрович – канд. мед. наук, руководитель Лаборатории фундаментальных исследовании в офтальмологии ФГБНУ «НИИГБ».

    Белкин Виталий Евгеньевич – врач-офтальмолог Филиала № 1 «Офтальмологическая клиника» ГБУЗ «ГКБ им. С.П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы.

    Самойленко Александр Игоревич – канд. мед. наук, зав. отделением витреоретинальной хирургии Филиал № 1 «Офтальмологическая клиника» ГБУЗ «ГКБ им. С.П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы

    Барышева Юлия Константиновна – врач-офтальмолог, ГБУЗ МО «Красногорская городская больница № 1»

Отредактировано Александр Саратов (2020-01-08 19:48:44)